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二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（下）

測(cè)序

根據(jù)研究需求和預(yù)算選擇合適的測(cè)序平臺(tái)，如 Illumina 測(cè)序平臺(tái)。它的測(cè)序原理主要是邊合成邊測(cè)序（SBS）。在測(cè)序過(guò)程中，dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）帶有不同顏色的熒光標(biāo)記，當(dāng)新的 dNTP 加入到正在合成的 DNA 鏈時(shí)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)確定堿基類型，從而讀取 cDN**段的序列。測(cè)序深度（覆蓋度）也是一個(gè)重要參數(shù)，一般來(lái)說(shuō)，測(cè)序深度越高，檢測(cè)到的低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的概率就越大，但成本也會(huì)相應(yīng)增加。

數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制是第一步，要去除低質(zhì)量的 reads（如含有較多不確定堿基 “N” 的 reads）和接頭序列。然后將高質(zhì)量的 reads 比對(duì)到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組上，常用的比對(duì)軟件有 TopHat、STAR 等。在確定了 reads 的位置后，就可以計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，常用的方法有 RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）、FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）等。此外，還可以進(jìn)行差異表達(dá)分析，找出在不同樣本條件下（如疾病組和健康組）表達(dá)量有***差異的轉(zhuǎn)錄本，用于后續(xù)的功能注釋和通路分析，了解這些轉(zhuǎn)錄本可能參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。 二代測(cè)序是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過(guò)低的問(wèn)題而出現(xiàn)的。山西哪里有二代測(cè)序檢測(cè)

二代測(cè)序—全外顯子測(cè)序的原理是什么？

全外顯子測(cè)序主要是利用序列捕獲技術(shù)，將基因組 DNA 中的外顯子區(qū)域富集起來(lái)，然后通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)（如第二代測(cè)序技術(shù) Illumina 測(cè)序平臺(tái)）對(duì)富集后的外顯子 DN**段進(jìn)行測(cè)序。其大致步驟包括 DNA 提取、片段化、文庫(kù)構(gòu)建、外顯子捕獲、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析等。例如，在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，將提取的基因組 DN**段化后，在片段兩端連接上特定的接頭序列，這些接頭序列可以用于后續(xù)的擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)。然后通過(guò)與外顯子區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸探針，將外顯子片段從全基因組 DNA 文庫(kù)中 “捕獲” 出來(lái)，經(jīng)過(guò)清洗去除未結(jié)合的 DN**段后，對(duì)捕獲的外顯子文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模的平行測(cè)序。 徐匯區(qū)二代測(cè)序分析一代、二代、三代測(cè)序的區(qū)別是什么？

二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)分別有哪些？

優(yōu)勢(shì)：能夠同時(shí)得到大量的序列數(shù)據(jù)，相比于一代測(cè)序技術(shù)，通量提高了成千上萬(wàn)倍;單條序列成本非常低廉。

劣勢(shì)：序列讀長(zhǎng)較短，Illumina平臺(tái)為250-300bp，454平臺(tái)也只有500bp左右;由于建庫(kù)中利用了PCR富集序列，因此有一些含量較少的序列可能無(wú)法被大量擴(kuò)增，造成一些信息的丟失，且PCR過(guò)程中有一定概率會(huì)引入錯(cuò)配堿基。想要得到準(zhǔn)確和長(zhǎng)度較長(zhǎng)的拼接結(jié)果，需要測(cè)序的覆蓋率較高導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤較多和成本增加。

二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域

1、基礎(chǔ)生物學(xué)研究：可以用于研究生物的發(fā)育過(guò)程。例如，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以了解不同階段胚胎細(xì)胞中基因的表達(dá)變化，揭示胚胎發(fā)育的分子機(jī)制。還可以用于物種進(jìn)化研究，比較不同物種間轉(zhuǎn)錄組的差異，推斷基因表達(dá)的進(jìn)化模式。

2、醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷：在疾病研究方面，用于尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。例如，在**研究中，通過(guò)對(duì)比**組織和正常組織的轉(zhuǎn)錄組，可以發(fā)現(xiàn)一些在**中特異性高表達(dá)或低表達(dá)的基因，這些基因有望成為**診斷、預(yù)后判斷的標(biāo)志物。同時(shí)，也可以用于藥物研發(fā)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序了解藥物作用后細(xì)胞基因表達(dá)的變化，評(píng)估藥物療效和毒性。

3、農(nóng)業(yè)和植物學(xué)研究：在作物育種中，可以研究不同品種作物在抗逆性（如抗旱、抗寒、抗病）等方面的基因表達(dá)差異，為培育優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。在植物生長(zhǎng)發(fā)育研究中，分析植物在不同生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)錄組變化，了解植物***等因素對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制。 二代測(cè)序常用于產(chǎn)前的檢測(cè)或診斷。

二代測(cè)序的建庫(kù)步驟①

一、樣本準(zhǔn)備

樣本采集：根據(jù)研究目的采**適的樣本，如血液、組織、細(xì)胞等。例如，在**研究中，可能會(huì)采集**組織和對(duì)應(yīng)的正常組織。對(duì)于血液樣本，一般采用靜脈穿刺采集外周血，收集在含有抗凝劑（如EDTA）的**管中，以防止血液凝固。組織樣本則需要在合適的條件下盡快處理，以保持核酸的完整性。如果是新鮮組織，可將其置于液氮中速凍，然后保存在-80℃冰箱中。

核酸提取：從樣本中提取高質(zhì)量的DNA或RNA。對(duì)于DNA提取，常用的方法有酚-氯仿抽提法和商業(yè)化的DNA提取試劑盒。酚-氯仿抽提法是利用酚和氯仿使蛋白質(zhì)變性，離心后使DNA處于水相，從而實(shí)現(xiàn)分離。試劑盒則是基于吸附柱的原理，DNA在特定的緩沖液條件下吸附在硅膠膜上，經(jīng)過(guò)洗滌和洗脫步驟得到純凈的DNA。RNA提取過(guò)程中，需要特別注意防止RNA酶的污染，因?yàn)镽NA酶***存在且很穩(wěn)定，容易降解RNA。一般會(huì)使用含有RNA酶抑制劑的試劑，如焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水來(lái)配制試劑，并且操作過(guò)程要在無(wú)RNA酶的環(huán)境中進(jìn)行，如使用無(wú)RNA酶的***頭和離心管。常用的RNA提取方法是Trizol法，Trizol試劑可以同時(shí)破碎細(xì)胞并使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離，然后通過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟得到RNA。 擴(kuò)增子測(cè)序是二代測(cè)序嗎？安徽哪里有二代測(cè)序分析

二代測(cè)序常用于醫(yī)學(xué)篩查或診斷。山西哪里有二代測(cè)序檢測(cè)

二代測(cè)序技術(shù)的一些***研究進(jìn)展②

植物基因組學(xué)研究領(lǐng)域 ：

花生四倍體野生種基因組測(cè)序：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)殷冬梅教授團(tuán)隊(duì)和上海交通大學(xué)韋朝春教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合發(fā)布了花生四倍體野生種近乎完整基因組 amon2.0 版本。該研究結(jié)合 ONT 超長(zhǎng)讀段、二代測(cè)序和 Hi-C 等多種測(cè)序技術(shù)，使基因組的連續(xù)性、完整性和準(zhǔn)確性都得到了顯著提高，為花生的遺傳馴化和分子育種提供了重要的基因組數(shù)據(jù)信息資源。

長(zhǎng)雄野生稻基因組解析：中科院昆明動(dòng)物所王文研究組與云南省農(nóng)科院糧食作物研究所胡鳳益研究組等中外機(jī)構(gòu)合作，利用二代測(cè)序技術(shù)成功組裝出高質(zhì)量的長(zhǎng)雄野生稻基因組，并對(duì)其與近緣物種的分歧時(shí)間、基因的收縮擴(kuò)張等進(jìn)行了分析，還鑒定出一批可能影響地下莖以及自交不親和性狀的候選基因及代謝途徑，為解析相關(guān)分子機(jī)制提供了重要線索。 山西哪里有二代測(cè)序檢測(cè)

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