北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理

一代、二代、三代測(cè)序的區(qū)別分別是什么？

一代測(cè)序是上世紀(jì)70年代由Sanger和Coulson開(kāi)創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序，也稱(chēng)為Sanger測(cè)序。

二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過(guò)低的問(wèn)題而出現(xiàn)的，能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo)。

三代測(cè)序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，這兩種技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)都可以達(dá)到幾-kb的級(jí)別，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二代測(cè)序技術(shù)。 基因組重測(cè)序是二代測(cè)序嗎？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理

二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（上）

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類(lèi)型。例如，研究**組織的轉(zhuǎn)錄組，就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本，同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照。RNA 提取方法有多種，常用的如 Trizol 法，它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要，需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或?qū)ｉT(mén)的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來(lái)評(píng)估 RNA 的完整性和純度。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量

完整性方面，通常使用 RNA 完整性指數(shù)（RIN）來(lái)衡量。RIN 值越高（一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA），說(shuō)明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過(guò)測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來(lái)估計(jì) RNA 純度，比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好。熒光定量法則是使用專(zhuān)門(mén)的熒光染料（如 Qubit）來(lái)更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度。

文庫(kù)構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集，一般使用帶有poly-T的磁珠來(lái)特異性地捕獲mRNA，因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過(guò)超聲或酶切等方法將cDNA片段化，片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)增加文庫(kù)的量，使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求。

重慶嘉安健達(dá)二代測(cè)序流程二代測(cè)序即高通量測(cè)序技術(shù)。

二代測(cè)序—全外顯子測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：1、疾病診斷：用于診斷各種遺傳性疾病，包括單基因遺傳病（如囊性纖維化、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等）和復(fù)雜疾?。ㄈ?*、心血管疾病等）。在**研究中，通過(guò)對(duì)**組織和正常組織進(jìn)行全外顯子測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的體細(xì)胞突變，這些突變可能是導(dǎo)致**發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，有助于醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案。2、藥物研發(fā)：幫助研究人員了解藥物靶點(diǎn)的基因變異情況。例如，如果發(fā)現(xiàn)某些患者的藥物靶點(diǎn)基因外顯子區(qū)域存在突變，可能會(huì)影響藥物的療效，從而可以針對(duì)性地開(kāi)發(fā)新的藥物或者調(diào)整藥物的使用劑量和方式。

遺傳學(xué)研究：用于研究人類(lèi)群體的遺傳多樣性，通過(guò)對(duì)不同人群的外顯子測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)不同人群之間的基因差異，這些差異可能與人群的適應(yīng)性、易感性等有關(guān)。還可以用于追蹤基因的進(jìn)化歷程，了解基因在進(jìn)化過(guò)程中的變化情況。

二代測(cè)序的建庫(kù)步驟④

四、接頭連接

接頭選擇：根據(jù)測(cè)序平臺(tái)的要求選擇合適的接頭。不同的二代測(cè)序平臺(tái)（如Illumina、IonTorrent等）有各自特定設(shè)計(jì)的接頭。這些接頭包含與測(cè)序平臺(tái)的流動(dòng)池（flowcell）表面互補(bǔ)的序列，用于將DNA片段固定在測(cè)序芯片上，還包含用于區(qū)分不同樣本的索引序列（index）等。

連接反應(yīng)：使用DNA連接酶將接頭與DNA片段連接。T4DNA連接酶是常用的連接酶，它可以在ATP（三磷酸腺苷）存在下，將接頭的5'-磷酸基團(tuán)與DNA片段的3'-羥基形成磷酸二酯鍵，從而將接頭連接到DNA片段的兩端。連接反應(yīng)的條件（如溫度、連接酶的用量、反應(yīng)時(shí)間等）需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化，以確保較高的連接效率。 單細(xì)胞測(cè)序也是二代測(cè)序。

二代測(cè)序技術(shù)的一些***研究進(jìn)展①

疾病診斷與***領(lǐng)域 ：消化系統(tǒng)**標(biāo)志物檢測(cè)：2024 年的**共識(shí)指出，二代測(cè)序（NGS）技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)消化系統(tǒng)**中的多種標(biāo)志物，如錯(cuò)配修復(fù)基因變異、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）狀態(tài)、**突變負(fù)荷（TMB）等，為**的精細(xì)***提供了更***、準(zhǔn)確的信息。例如，MSI-H 的實(shí)體瘤患者可使用帕博利珠單抗進(jìn)行***，而 NGS 技術(shù)能更好地檢測(cè) MSI 狀態(tài)及相關(guān)耐藥機(jī)制。

**液體活檢：通過(guò)檢測(cè)血液中的循環(huán)** DNA（ctDNA）等標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)**的早期篩查、診斷和***監(jiān)測(cè)。NGS 技術(shù)能夠更敏感地檢測(cè)到 ctDNA 中的基因突變和變異，為**的無(wú)創(chuàng)診斷提供了有力支持。

二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是高靈敏度。河南嘉安健達(dá)二代測(cè)序分析

二代測(cè)序是2005年以后開(kāi)始的嗎？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理

宏基因組二代測(cè)序，你了解多少？

宏基因組二代測(cè)序（mNGS）是一項(xiàng)覆蓋病原譜廣且高通量的檢測(cè)技術(shù)，已在臨床領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。對(duì)于血液病患者，病原mNGS通過(guò)對(duì)樣本快速高通量測(cè)序，可以獲得更準(zhǔn)確、相對(duì)無(wú)偏倚的病原信息，對(duì)病原診斷起到積極的作用，尤其對(duì)傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)未覆蓋到或檢測(cè)周期較長(zhǎng)、陽(yáng)性率較低的病原可提高檢出率。對(duì)于臨床相關(guān)樣本應(yīng)首先完善傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)，病理、無(wú)菌標(biāo)本培養(yǎng)仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，病原mNGS是對(duì)傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測(cè)的有力補(bǔ)充和延展而非替代。病原mNGS的報(bào)告解讀應(yīng)充分評(píng)估檢出微生物的致病性、流行病學(xué)、生物信息學(xué)信息，同時(shí)在結(jié)合患者臨床特征的基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合判斷。 北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理