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二代測(cè)序的建庫(kù)步驟①

一、樣本準(zhǔn)備

樣本采集：根據(jù)研究目的采**適的樣本，如血液、組織、細(xì)胞等。例如，在**研究中，可能會(huì)采集**組織和對(duì)應(yīng)的正常組織。對(duì)于血液樣本，一般采用靜脈穿刺采集外周血，收集在含有抗凝劑（如EDTA）的**管中，以防止血液凝固。組織樣本則需要在合適的條件下盡快處理，以保持核酸的完整性。如果是新鮮組織，可將其置于液氮中速凍，然后保存在-80℃冰箱中。

核酸提取：從樣本中提取高質(zhì)量的DNA或RNA。對(duì)于DNA提取，常用的方法有酚-氯仿抽提法和商業(yè)化的DNA提取試劑盒。酚-氯仿抽提法是利用酚和氯仿使蛋白質(zhì)變性，離心后使DNA處于水相，從而實(shí)現(xiàn)分離。試劑盒則是基于吸附柱的原理，DNA在特定的緩沖液條件下吸附在硅膠膜上，經(jīng)過(guò)洗滌和洗脫步驟得到純凈的DNA。RNA提取過(guò)程中，需要特別注意防止RNA酶的污染，因?yàn)镽NA酶***存在且很穩(wěn)定，容易降解RNA。一般會(huì)使用含有RNA酶抑制劑的試劑，如焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水來(lái)配制試劑，并且操作過(guò)程要在無(wú)RNA酶的環(huán)境中進(jìn)行，如使用無(wú)RNA酶的***頭和離心管。常用的RNA提取方法是Trizol法，Trizol試劑可以同時(shí)破碎細(xì)胞并使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離，然后通過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟得到RNA。 二代測(cè)序需要多久才能完成？徐匯區(qū)哪里有二代測(cè)序價(jià)格

二代測(cè)序的建庫(kù)步驟③

三、末端修復(fù)和加A尾（以DNA文庫(kù)為例）

末端修復(fù)：經(jīng)過(guò)片段化后的DNA末端可能是不平齊的，有5'-突出端或3'-突出端。末端修復(fù)反應(yīng)可以利用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶，將這些末端補(bǔ)平，使其成為平末端。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，在合適的反應(yīng)緩沖液和dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）存在下，可以將突出的末端補(bǔ)平。

加A尾：在末端修復(fù)后的平末端DNA分子的3'-末端加上一個(gè)A堿基。這一步是為了后續(xù)連接帶有T-突出端的接頭做準(zhǔn)備，一般使用Klenow片段（3'→5'外切酶活性缺失）在dATP存在下進(jìn)行加A反應(yīng)，這樣可以使DNA片段能夠高效地與帶有T-突出端的測(cè)序接頭連接。 徐匯區(qū)哪里有二代測(cè)序公司一代和二代測(cè)序的區(qū)別？

二代測(cè)序的建庫(kù)步驟⑤

五、文庫(kù)富集（可選步驟）

PCR富集：對(duì)于一些起始樣本量較少或者連接效率較低的情況，可能需要進(jìn)行PCR富集。利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，增加文庫(kù)中目標(biāo)DNA片段的數(shù)量。在PCR反應(yīng)中，需要注意引物的設(shè)計(jì)要與接頭序列準(zhǔn)確匹配，并且要優(yōu)化PCR循環(huán)數(shù)，避免過(guò)度擴(kuò)增導(dǎo)致文庫(kù)多樣性降低或引入PCR偏差。一般會(huì)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的PCR循環(huán)數(shù)，例如從10-15個(gè)循環(huán)開始嘗試，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量和質(zhì)量來(lái)調(diào)整循環(huán)數(shù)。

二代測(cè)序技術(shù)在不同人群中的準(zhǔn)確性有何差異③

孕婦及胎兒

優(yōu)勢(shì)：無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查（NIPT）是二代測(cè)序技術(shù)用于孕期胎兒常見染色體非整倍體篩查的應(yīng)用，對(duì)于唐氏綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等染色體異常疾病的檢測(cè)準(zhǔn)確率分別能達(dá)到95%、85%、75%以上，明顯高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查。

局限性：孕婦外周血中胎兒游離DNA來(lái)源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，可能與胎兒實(shí)際情況不一致，導(dǎo)致假陽(yáng)性。母親若合并免疫疾病、凝血功能障礙等，會(huì)使外周血中游離DNA含量過(guò)高，掩蓋胎兒來(lái)源的游離DNA，造成假陰性510. 二代測(cè)序常用于產(chǎn)前的檢測(cè)或診斷。

對(duì)于二代測(cè)序的概念是什么？

第二代測(cè)序(Next-generationsequencing，NGS)又稱為高通量測(cè)序(High-throughputsequencing)，是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來(lái)的DNA測(cè)序技術(shù)。我們都知道一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序，而二代測(cè)序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序(SequencingbySynthesis)。二代測(cè)序在DNA復(fù)制過(guò)程中通過(guò)捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記(一般為熒光分子標(biāo)記)來(lái)確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche的454FLX、lllumina的Miseq/Hiseg等。2005年，羅氏推出了二代測(cè)序儀羅氏454，生命科學(xué)開始進(jìn)入高通量測(cè)序時(shí)代。2006年，隨著Ilumina系列測(cè)序平臺(tái)的推出，極大降低了二代測(cè)序的價(jià)格，推動(dòng)了高通量測(cè)序在生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域的普及。 什么是二代測(cè)序技術(shù)？廣西二代測(cè)序運(yùn)用

二代測(cè)序是一種能夠同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)十個(gè)億DNA片段進(jìn)行測(cè)序的方法。徐匯區(qū)哪里有二代測(cè)序價(jià)格

什么樣本可以做二代測(cè)序？③

細(xì)胞樣本

培養(yǎng)細(xì)胞：包括各種原代培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序可以了解細(xì)胞的基因特征和功能變化。例如，在研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)，對(duì)經(jīng)過(guò)特定刺激處理的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以分析基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)情況。

脫落細(xì)胞：如痰液中的脫落細(xì)胞、尿液中的脫落細(xì)胞等。這些細(xì)胞可以用于某些疾病的篩查。例如，在肺*篩查中，對(duì)痰液中的脫落細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)，通過(guò)二代測(cè)序?qū)ふ曳?相關(guān)的基因突變，作為一種非侵入性的檢測(cè)方法。 徐匯區(qū)哪里有二代測(cè)序價(jià)格